TP « extraction d’ADN plasmidique par méthode rapide » et « Digestion enzymatique de plasmides ».

Nous,  étudiants du BTS ANABIOTEC de 1ere année, avons commencé les TP de biologie moléculaire il y a deux semaines. Le premier TP était l’extraction d’ADN des bactéries E.coli par la méthode au chloroforme. La manipulation a été hésitante par la plupart d’entre nous. C’était notre premier TP de biologie moléculaire. Néanmoins nous avons réussi à extraire de l’ADN en plus ou moins grande quantité selon les binômes.

La semaine dernière, pour notre deuxième TP de biologie moléculaire, nous devions extraire de l’ADN plasmidique ( plasmide pUC) par une méthode plus rapide. Pour cela nous avons utilisé un kit d’extraction. Contrairement à la semaine précédente, le protocole du TP était en Anglais. Nous avons donc du préalablement traduire le protocole.

Une fois arrivé en laboratoire de biologie, nous avons préparé nos paillasses et le matériel dont nous avions besoin.  La préparation d’ADN plasmidique à partir de bactéries  est une technique les plus courantes de la biologie moléculaire. Le principe de l’extraction est connu sous le nom de lyse alcaline. Cette méthode permet de préparer sélectivement l’ADN plasmidique contenu dans  E.coli tout en éliminant l’ADN du chromosome bactérien.  Lorsque l’ADN plasmidique est extrait on peut voir un culot de couleur blanchâtre dans nos micro-tubes.

Après, nous avons procédé à la digestion enzymatique de deux plamides pUC et pBR322. Les enzyme de restriction EcoR1  et Hind III ont été utilisées. La digestion de plasmide par une enzyme de restriction permet l’ouverture et l’insertion sur un fragment d’ADN étranger, par exemple un gène. Si on utilise plusieurs enzymes de restriction sur un fragment d’ADN circulaire ou linéaire, on obtient une carte de restriction. Une carte de restriction est une véritable carte d’identité d’une molécule d’ADN. Ensuite, pour tout le monde, nous devions remplir 3 micro-tubes différents selons le tableau suivant:

Ensuite nous avons mixé chaque micro-tube par pipettage et nous avons centrifugé quelques secondes à la mini-centrifugeuse. Puis nous avons mis à incuber à  37°C pendant 2h. Pour toutes ces manipulations nous avons eu un temps de 3 heures (comme tous nos TP). Nous n’avons donc pas pu voir nos résultats. Mais nous allons les avoir mardi prochain.

Pour ma part, ce TP a été très enrichissant. J’ai pu perfectionner le pipettage à la micro-pipette ainsi que les prélèvements délicats à la micro-pipette (ici pour ne pas prélever l’ADN plasmidique du culot mais que le surnageant). Il faut aussi être très organisé et nous devons savoir ce que nous faisons. J’étais seule lors de ce TP car ma binôme était absente. Je me suis rendu compte que je manipulais plus vite mais je mettais plus de temps à prendre tout le matériel dont j’avais besoin. Je me suis aperçu qu’il y avait des contraintes différentes celons les manipulations: pour la deuxième partie du TP nous devions avoir tous nos réactifs et solutions dans la glace. Ce TP nous a permis aussi de pouvoir utiliser plusieurs appareils comme la centrifugeuse (micro et mini), le spectrophotomètre et les micro-pipettes. La diversité des manipulations et des instruments sont pour moi un atout et une bonne vision de notre futur travail en temps que Technicien Supérieur.

Extraction de plasmides (TP 1ère année)

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